浙江大学高长有教授课题组：仿病毒形貌和成分的自组装纳米粒子促进胞吞并提高癌症治疗效果

图1. 示意图，显示了负载吲哚菁绿（ICG）的仿病毒纳米粒子（VM-T-L NPs）和对应的对照粒子的制备、结构、细胞吞噬和光热效应。VM-T-L NPs表面具有刺突结构和Tat /脂质功能分子，对于增强细胞吞噬和ICG传递具有优异的表现，可导致癌细胞死亡和肿瘤抑制。

1. 通过一种新颖的pH响应性分解诱导自组装方法和后续功能成分修饰，制备了具有仿病毒形态和组成的纳米粒子。

2. 以仿病毒纳米粒子作为传递载体，极大提高了细胞吞噬、药物传递效率和抗肿瘤作用。

1. 仿病毒形貌和成分的纳米粒子的制备

首先，通过乳化-交联法制备了壳聚糖纳米粒子。通过醛基与氨基间的Schiff碱反应将合成的2-醛基-5,10,15,20-四苯基卟啉（Por-CHO）接枝到壳聚糖纳米粒子中的壳聚糖分子上，得到壳聚糖接枝卟啉纳米粒子（CS-g-Por NPs）。将CS-g-Por 纳米粒子加入到pH 1盐酸中处理，通过Schiff 碱键分解和卟啉基团自组装，形成刺突形貌，获得表面粗糙的仿病毒形貌的纳米粒子（VM-NPs）。

利用VM NPs 中残留的戊二醛醛基与Tat 穿膜肽的氨基反应，将Tat 穿膜肽修饰到VM NPs，得到VM-T NPs。VM-T NPs 中，穿膜肽与壳聚糖共价相连，类似于病毒的糖蛋白结构。

通过VM NPs 表面的疏水性卟啉刺突结构修饰脂质1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）（~55 mol%）和胆固醇（~45 mol%），制备VM-L NPs。为利用Tat 穿膜肽和脂质的的协同作用促进胞吞，进一步模拟病毒化学组成，利用上述组成的脂质修饰连接Tat 穿膜的粒子VM-T NPs，得到VM-T-L NPs（图2）。

图2. 仿病毒纳米粒子的表征。（A-C）（A）平滑CS-g-Por NPs，（B）仿病毒纳米粒子VM NPs和（C）VM-T-L NPs的代表性TEM图像。比例尺：200 nm。插图是较高放大率的图像。比例尺：100 nm。通过将CS-g-Por NPs在0.1 M HCl中处理15分钟制备VM NPs。通过依次用Tat肽和HIV脂质修饰VM NPs制备VM-T-L NPs。不同NPs在水中的（D）大小和（E）zeta电位。

2. 仿病毒纳米粒子的胞吞

为研究仿病毒纳米粒子对胞吞的影响，选择HeLa 人类宫颈癌细胞、 HepG2人类肝癌细胞两种细胞系。通过与表面相对光滑的CS-g-Por NPs、CS NPs 对比，以及VM-T-L NPs、VM-T NPs、VM-L NPs、VM NPs 间对比，研究仿病毒形貌和组成粒子对胞吞的影响。实验结果表明，仿病毒形貌和组成的纳米粒子极易被细胞吞噬，类似于病毒对细胞具有很强的侵染性。仿病毒形貌的 VM NPs 相比于光滑纳米粒子 CS-g-Por NPs、CS NPs，可大大促进胞吞(图3)。粒子负载光敏剂吲哚菁绿ICG后，HeLa 细胞与HepG2 细胞对其胞吞与负载ICG 前类似（图4）。

图3. HeLa细胞对仿病毒纳米粒子胞吞的定量和定性分析。（A-D）流式细胞术检测结果显示，将FITC标记的纳米粒子与HeLa细胞在80 μg/mL的浓度下共培养1 h和3 h后（A，B），以及分别以20、40和80 μg/mL的浓度共培养3 h后（C，D），其胞吞率（A，C）和胞吞量（B，D）。数据表示为平均值±标准差，n =3，** p <0.01，在相同的实验条件下，VM-T-L、VM-T和VM-L NPs vs. VM、CS-g-Por和CS NPs。（E-J）HeLa细胞与VM-T-L NPs（E）、VM-T NPs（F）、VM-L NPs（G）、VM NPs（H）、CS-g-Por NPs（I）和CS NP（J）在浓度为80 μg/mL下共培养3 h后的CLSM图像。绿色、红色和蓝色分别代表纳米粒子、溶酶体和细胞核。

图4. 负载ICG的纳米粒子的表征以及HeLa细胞对负载ICG的纳米粒子吞噬的定量分析。（A，B）水中不同负载ICG纳米粒子的zeta电位（A）和大小（B）。（C，D）流式细胞术检测结果显示，在以80 μg/mL（ICG 负载量20 μg/mL） 分别共培养1 h和3 h后，其胞吞率（C）和胞吞量（D）。（C，D）中的数据表示为平均值±标准差，n=3，** p <0.01，在相同的实验条件下，VM-T-L@ICG、VM-T@ICG和VM-L@ICG NP vs. VM @ ICG、CS-g-Por@ICG和CS@ICG NPs。

3. 负载ICG仿病毒纳米粒子的体外光热治疗（PTT）效果

通过MTT 法检测负载ICG粒子对HeLa 细胞和HepG2 细胞的光热杀伤效果。结果显示，仿病毒纳米粒子促进了所负载的ICG 的细胞传递，光照下引起细胞内活性氧水平的急剧升高，从而增强了细胞毒性，对细胞起到杀伤作用（图5）。相同浓度下，按ICG、CS-g-Por@ICG、CS@ICG、VM@ICG、 VM-L@ICG、VM-T@ICG、VM-T-L@ICG 的顺序，光热杀伤细胞的效果依次增加。例如100 μg/mL 时，VM-T-L@ICG 、VM-T@ICG、VM-L@ICG 细胞存活率分别只有14%、18%和20%；形成明显对比的是，相同条件下ICG、CS-g-Por@ICG 和CS@ICG 细胞存活率仍高达80%以上。

图5. 负载ICG纳米粒子的体外光热效应和光热治疗效果检测。（A）光照下（808 nm，1 W/cm²），负载ICG的纳米粒子和游离ICG的光热效应。（B-G）叠加的荧光和明场显微镜图像，显示HeLa细胞与浓度为100 μg/mL（ICG负载量25 μg/mL）的VM-T-L@ICG（B）、VM-T@ICG（C）、VM-L@ICG（D）、VM@ICG（E），CS-g-Por@ICG（F）和CS@ICG（G）共培养3小时，然后进行光照（808 nm，1 W/cm²，10 s）后ROS的产生。（H）HeLa细胞中ROS的相对浓度。数据为分析显微镜图像中荧光强度获得。（I）将HeLa细胞与浓度为75 μg/mL（ICG负载量18 μg/ mL）或100 μg/mL（ICG负载量25 μg/mL）的负载ICG纳米粒子和18 μg/mL或25 μg ICG共培养3 h，再分别光照（808 nm，1 W/cm²，30 s）或不光照后的细胞活性。（J）将HeLa细胞与100 μg/mL（负载量25μg/mL）负载ICG纳米粒子和25 μg/mL ICG共培养3 h，再进行光照（808 nm，1 W/cm²，30 s）或不进行光照后，凋亡检测结果。（H-J）中的数据表示为平均值±标准差，n =5，* p <0.05，在相同的实验条件下VM-T-L@ICG、VM-T@ICG和VM-L@ICG NPs vs. VM@ICG、CS-g-Por@ICG、CS@ICG NPs和ICG。

4. 负载ICG仿病毒纳米粒子的体内光热治疗效果

利用带有HeLa 肿瘤的裸鼠进行了负载ICG 纳米粒子体内光热治疗研究。与其他各组形成鲜明对比的是，光照下VM-T-L@ICG 实验组在21 天后未发现肿瘤，说明肿瘤被完全清除（图6）。可以推断，当负载ICG 的纳米粒子注入到肿瘤中后，由于VM-T-L@ICG 纳米粒子能够显著促进胞吞，ICG 的细胞传递效率显著高于其他组。

图6. 负载ICG仿病毒纳米粒子的体内光热效应。（A）分别被指定处理并培养21天后，裸鼠中的肿瘤体积。数据表示为平均值±标准差，n = 5，** p <0.01，与其他组相比。“ L”代表激光照射（808 nm，1 W/cm²，5 min）。每组中的每只小鼠被注射指定的负载有25 μg ICG的纳米粒子或25 μg ICG。（B-E）Ki-67染色的从小鼠采集的肿瘤光学图像。小鼠用（B）VM-T-L@ICG+L、（C）CS-g-Por@ICG+L、（D）CS@ICG+L和（E）ICG+L 治疗后21天采集的肿瘤。（F）在808 nm激光照射不同时间下，VM-T-L@ICG、CS-g-Por@ICG、CS@ICG、ICG和生理盐水对荷瘤小鼠的光热效应。（G，I）CLSM图像和（H，J）CLSM、明场叠加图像，显示了VM-T-L@ICG纳米粒子（绿色荧光）在荷HeLa瘤小鼠体内向肿瘤中的渗透。（I）和（J）分别是（G）和（H）中矩形区域的相应放大图像。