如何跨越10纳米分辨率极限

由于衍射极限的存在，宽场显微镜的分辨率被限制在横向 200nm，轴向 600nm，视野中横向或轴向距离小于这两个数值的两点就无法被区分。为了跨越这一衍射极限，2006 年，Betzig 和庄小威等人同时且分别提出 PALM 和 STORM 两种单分子定位成像技术。

 

单分子成像技术是现存最灵敏、分辨率最高的显微成像技术之一，它使用不同种类的特殊染料使得荧光分子的发光有一定的时序，避免了分子同时发光导致的相互遮蔽，因此超越了衍射极限，将分辨率提升至 ~20nm。但是，20nm 的分辨率尚不足以用于探测真正意义上的“分子”，而实现对尺寸在数纳米的小分子的探测又对理解真实生命体中的生化反应至关重要。

图1：单分子定位成像技术原理示意图

图源：Nat Methods 3, 793–796 (2006), Fig. 1

单从原理上看，单分子定位甚至能实现无限小的分辨率，影响其分辨率的可能只有噪声带来的定位精度下降这一因素。人们相信 20nm 远不是这一技术的分辨率极限，因此很多研究人员付出了大量的努力，不断开发出分辨率更高、性能更加优越的成像系统。但是，这些研究不约而同地遇到了“10 纳米”这一壁垒，主要体现在两个方面：

1）当小分子间的距离为几个纳米时，荧光分子的探测率都下降严重，因此许多微小的结构信息都被成像系统遗漏；

2）荧光分子发射光子的各向异性会引发大量的定位误差。

这些因素都导致 10 纳米成为单分子定位技术分辨率的“极限”。

这一极限产生的原因是什么呢？又是怎样才能克服它呢？

图2：光开关指纹分析：光开关循环发生率如指纹一样独特又如条形码一样成为分子距离的读取途径

图源：Dr. Gerti Beliu, Rudolf Virchow Center‍‍‍‍‍‍‍‍‍

为了研究这些问题，来自德国维尔茨堡大学的 Dominic A. Helmerich，Markus Sauer 等人研究了用不同间隔距离荧光标记的 DNA 折纸，发现了荧光分子光开关动力学与间距之间的关系，并提出了将光开关指纹分析与时间分析荧光探测相结合，以跨越这一分辨率极限。

文章发表在 Nature Methods，题为“Photoswitching fingerprint analysis bypasses the 10-nm resolution barrier”。

  10 纳米分辨率极限的产生  

STORM 技术常用的标记染料分子为 Cy5，这种染料在特定波长 λ_ON→OFF 下保持全灭状态，在另一种波长 λ_OFF→ON 下可以被激活发光。那么，当标记片段中的两个 Cy5 分子之间距离小于10nm时，它们的激发/熄灭状态是怎样变化的呢？

为了研究这一问题，作者在 DNA 折纸样品中分别以 18，9，6，3nm 的距离标记上 Cy5 染料，结果发现任何一种单分子技术都无法分辨距离 10nm 以下的两个标记。同时，在记录下的成像视频中的前 1 秒内，荧光染料会 _ON→OFF 发生快速的“闪烁”。这种闪烁的速率远远大于荧光染料在不同波长激光作用下发生的正常状态切换速率。

这种速率很快的“闪烁”引起了作者的注意。Cy5 染料的光转换循环次数是有限的，循环超过这一次数之后，染料分子就会被漂白，无法再发光了，因此导致了分子发光探测率下降的问题，影响了成像质量。这一现象背后的原因是什么呢？为了解释这一现象，作者引入了荧光共振能量转移(FRET)的概念。

FRET 是一种发生在两个距离较近的荧光分子间的能量转移现象。当两个荧光分子距离小于 10nm 时，一个分子的能量波长如果在另一个分子的吸收谱范围之内，就可以被另一个分子吸收，从而使另一个分子也发光。辐射的能量多少与两分子间的距离有着单射关系。对于 Cy5 染料分子来说，熄灭状态下的吸收谱相对较宽，因此当激发状态的分子和熄灭状态的分子距离小于 10nm 时，就可以发生能量转移，使得熄灭的分子再度发光。

图3：荧光共振能量转移原理示意图

图源：Olympus-lifescience.com.cn

  10 纳米分辨率极限的跨越  

FRET 常常借助荧光寿命这一参数实现成像，常用手段包括时间相关单光子技术（TCSPC）等等。与之相似的，在 dSTROM 中，作者提出了光开关指纹分析，即记录荧光分子的强度以及寿命随着时间的变化，发现 Cy5 染料分子的距离小于 10nm 时，距离与荧光寿命同样存在一定的单射关系。两分子距离越近，FRET 现象越明显，发生分子间能量转移的可能性越大，那么 Cy5 的漂白速度就越快，荧光寿命也就越短。这一特征就像是分子定位独一无二的“指纹”，读取它就可以在 dSTORM 实现 10nm 以下的分辨率。

图4：Cy5 分子不同距离下的荧光寿命（左上：18nm；右上：9nm；左下：6nm；右下：3nm）

图源：Nat Methods 19, 986–994 (2022), Fig. 2

为了将这一探测手段真正地应用在生物学样品上，需要更加有效以及精准的荧光标记，以实现对像个仅有几纳米的生物分子位点的特异性标记。针对这一问题，作者采用了将有机染料直接共价位点特异性的附着到感兴趣的蛋白质的策略，可以实现对细胞内外蛋白质位点的特异性高效标记，误差仅为 1 纳米。利用这种特异性标记和光开关指纹分析相结合，作者观测了质膜上的多聚体受体，并首次估计了细胞中受体亚基之间 5-7nm 的距离，还确定了标记亚基的数量。

总之，为了跨越单分子定位显微镜 10 纳米的分辨率极限，一种光开关指纹分析方法结合特异性标记的单分子成像技术被提出，可以分辨小于 10nm 的结构。这一方法可以助力对细胞结构、细胞器和多蛋白复合物的分子组织的研究，并实现以光学方法阐明蛋白质结构。

  论文信息  

Helmerich, D. A. et al. Photoswitching fingerprint analysis bypasses the 10-nm resolution barrier. Nat Methods 19, 986–994 (2022).

https://doi.org/10.1038/s41592-022-01548-6

文章来源：中国光学

撰稿：yvon