细胞治疗：免疫细胞治疗中基因线路设计的新进展

细胞是复杂的信息处理系统，可以感知不同的环境信号，执行复杂的计算，并产生一系列广泛的输出，如基因表达，信号分子分泌，形态变化和细胞生长。许多细胞类型在不同环境中已经进化出生存和执行各种任务的专门能力。尤其是肿瘤治疗中最重要的人体免疫细胞。嵌合抗原受体(CAR) T细胞疗法在血液肿瘤的成功证明了使用基因工程细胞作为治疗剂的潜力，但依旧面临许多挑战。细胞免疫疗法最关注的问题之一是由工程免疫细胞的过度活化和肿瘤外靶向引起的毒性（安全性与有效性）。而细胞疗法可以通过设计复杂的基因线路，以提高其靶向特异性、安全性和有效性。

近期，波士顿大学的Ahmad S. Khali与Wilson W. Wong教授等人在cell system上发表了题为“Recent progress of gene circuit designs in immune cell therapies”的最新综述，概述了针对临床需求的细胞治疗控制线路的设计考虑。通过对比一些最新控制电路开发中关键的设计特征，讨论了未来细胞治疗控制线路潜在的发展方向。 

虽然目前有许多不同类型的基因回路，但它们可以大致分为两类:细胞自主控制和外源控制（图1）。细胞自主控制基因回路依赖于来自工程免疫细胞或自然环境的信号。相比之下，外源控制基因回路依赖于来自外部试剂的信号，如小分子、光或超声波。这两种方法各有优劣，有不同的适用场景，自主控制的线路可以在没有外源干预的情况下工作，但它是有不可预测性，这在临床治疗中是不能接受的，所以外源控制的线路仍然是十分重要的，它可以通过采用全身或是局部输入，进而达到控制免疫细胞的功能。

图1. 细胞自主控制回路与外源控制回路对比图

在细胞自主控制的基因线路中，多抗原识别是提高肿瘤靶向性，降低脱靶毒性比较好的方法，文中重点介绍三种最先进的逻辑线路。第一种是最通用的SUPRA CAR(图2B）,具有高度模块化，由T细胞上表达的通用受体（zipCAR）和肿瘤靶向单链抗体适配器（zipFv）组成。通过改变zipFv的数量以及抗原特异性激活程度可以调节CAR激活的信号强度。但由于衔接分子（亮氨酸拉链）是一种蛋白质，zipFv可能对相关组织的渗透性较低，半衰期较短，并具有潜在的未知免疫反应。

第二种是Synnotch 设计(图2C)，由抗原识别结构域、Notch的跨膜核心区，合成的转录因子组成。近期，加州大学旧金山分校Roybal团队开发了一组类似于SynNotch的人源化的膜内蛋白水解受体(SNIPR)。在之前的文章中Notch核心来自于小鼠，合成转录因子（TF）是来源于酵母和病毒蛋白，在人源化SNIPR设计中，这些元件都换成了人源化的，将蛋白质的免疫原性降低到与目前临床使用的 CAR 相当的水平。此外，与第一代 SynNotch 相比，人源化 SNIPR 的体积更小、表达良好、具有对低水平抗原的高敏感性以及被一系列配体激活的潜力。但目前的研究仅关注 T 细胞，因此作者SNIPR设计的普遍性仍有待确定。

图2.受体逻辑线路图

第三种是Co-LOCKR系统(图2D)，它的功能是通过Cage和Key这两个衔接蛋白实现的。cage和key可以相互作用，当目标抗原存在的情况下可调节cage衔接蛋白与CAR的结合方式。每个衔接蛋白都有一个抗原结合域。其中cage蛋白含有一种能结合和激活CAR T细胞的肽。但肽的结构域被锁存结构域隔离。当key与cage蛋白结合时，它会引起构象变化，并暴露出结合肽，从而激活CAR。且cage和key蛋白不在溶液中相互作用，仅当被抗原结合域共定位到细胞表面时，才可以激活CAR。

图3.基于细胞状态的细胞线路控制

此外，肿瘤微环境中也具有许多免疫抑制因子和炎症因子，也会限制细胞的免疫功能。所以，免疫细胞可以被设计成检测肿瘤微环境的某些特征(缺氧及低PH)，进而产生增强抗肿瘤活性。比如说针对肿瘤微环境的低氧特点，以低氧为输入信号，来提高肿瘤靶向特异性(图3A)。或者以肿瘤特异性蛋白酶作为癌症诊断和治疗发展的标志物(图3B)，通过在scFv结构域之前添加具有蛋白水解位点的掩蔽肽，在存在肿瘤特异性蛋白酶的情况下，掩蔽肽被切割，从而暴露scFv并允许抗原结合和激活CAR T细胞。还有以CAR激活为条件，进而控制局部细胞因子的产生（图3C）。

外源控制线路的最重要目标之一是在出现不良副作用时，及时限制T细胞活性来增强安全性，或提高肿瘤靶向特异性。因此，诱导剂的药代动力学和安全性是两个很重要的基本参数。目前，有三类外源基因控制电路，按类型可分为：小分子、光和超声波（图4）。当在免疫细胞中实施时，每个系统都充当一个ON或OFF开关，由外源诱导剂来调节这种变化。然后线路就需要持续存在以保持ON或OFF状态。因此，诱导剂的毒性和递送方法很重要。

图4.通过光或超声波控制的细胞外源回路

小分子药物门控CAR T细胞，最简单方法是直接控制CAR的活性。在ON开关中，小分子的结合可以稳定降解物或抑制蛋白水解。在OFF开关，小分子诱导剂的存在，可将招募内源性蛋白酶水解。由于小分子的扩散效应和组织渗透性慢，相比之下，使用光感受器的基因编码二聚体可以通过高时空分辨率的光，实现局部、无创的蛋白质相互作用。通过一种光诱导核易位和二聚化基因激活系统，实现对肿瘤杀伤的无创控制。此外由于CAR-T细胞可能攻击目标抗原低水平表达的正常组织，研究人员用聚焦超声波FUS触发CAR的表达，实现对CAR的精准控制（在空间上控制CAR）,从而减少on target, off tumor的问题。

细胞自主和细胞外源控制这两种方法不是互斥的，它们可以协同使用，将进一步增强CAR T细胞治疗的整体效果。尽管这里讨论的许多想法还处于早期阶段，但其中一些想法比其他想法更接近临床。目前，逻辑CAR似乎势头最猛。本文描述的一些药物诱导CAR和基因开关，特别是那些使用临床批准药物的CAR，可以提供所需的安全控制，因此很可能在不久的将来进入临床。

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翻译整理/姜思琦

编辑/王巧琪

文章来源：细胞与基因线路设计