直播预告 | 高效液相色谱仪HPLC设备原理、操作及应用

HPLC全称为高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography)。是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各组分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

由于HPLC分析不受温度和样品沸点限制，因此具有更广阔的应用潜力。经过30多年的迅速发展，高效液相色谱法在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟，现已成为化学化工、环境、药学、食品等多个领域中最具优势的分离分析方法之一。

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类型

HPLC 包含各种类型或操作模式，每种类型或模式都是根据特定的分离需求或分析目标量身定制的。以下是一些常见的类型：

1.正相 HPLC (NP-HPLC)

• 固定相：极性（通常为硅胶）。
• 流动相：非极性溶剂。
• 应用：根据化合物极性进行分离。适用于具有弱至中等极性相互作用的极性化合物。

2.反相 HPLC（RP-HPLC）

• 固定相：非极性（通常为疏水性）键合相，如 C18。
• 流动相：极性溶剂（如水）与有机溶剂（如乙腈或甲醇）混合。
• 应用：广泛用于分离非极性和中等极性化合物。常用于药物和化学分析。

3.离子交换色谱法（IEC）

• 固定相：具有离子交换功能基团（如阴离子交换或阳离子交换）的树脂或色谱柱。
• 流动相：不同 pH 值的缓冲水溶液。
• 应用：根据离子或带电分子与固定相的离子相互作用来分离离子或带电分子。常见于蛋白质纯化和带电物质分析。

4.体积排阻色谱法（SEC）或凝胶渗透色谱法（GPC）

• 固定相：具有各种孔径的多孔珠。
• 流动相：缓冲水溶液。
• 应用：根据分子的大小和形状分离分子。适用于表征大分子和分析聚合物。

5.亲和层析

• 固定相：与目标分子（如抗体）特异性结合的固定配体。
• 流动相：缓冲溶液。
• 应用：具有高度选择性，可用于纯化和分离特定的生物大分子，如蛋白质、酶或抗体。

6.亲水作用色谱法（HILIC）

• 固定相：极性但亲水的固定相。
• 流动相：水和有机溶剂的混合物。
• 应用：适用于分离极性和亲水性化合物，包括高极性代谢物和糖蛋白。

7.手性色谱法

• 固定相：手性固定相。
• 流动相：与添加剂混合的有机溶剂。
• 应用：手性化合物的对映选择性分离，在医药和农用化学品分析中尤为重要。

8.超临界流体色谱（SFC）

• 固定相：以超临界二氧化碳为主要流动相的色谱柱。
• 流动相：超临界流体，通常与助溶剂一起使用。
• 应用：适用于分离非极性和中等极性化合物以及手性分离。

9.联用技术：如LC-MS（液相色谱-质谱法）和LC-NMR（液相色谱-核磁共振法）。

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数据分析

数据分析是 HPLC 法的一个重要方面，因为它涉及到解释色谱分离过程中收集的信息以及量化相关化合物。以下是 HPLC 数据分析的关键组成部分和技术：

1.色谱图解读：

色谱峰：HPLC 色谱图的主要特征是色谱峰。每个峰代表样品中的一种化合物，其特性（如保留时间和峰形）可提供有关化合物特性和纯度的信息。保留时间：化合物从色谱柱洗脱所需的时间（保留时间）是一个关键参数。它可用于化合物鉴定以及与参考标准进行比较。峰面积和峰高度：峰下面积（峰面积）或峰的最大高度（峰高）与化合物的浓度成正比。使用积分软件可准确计算峰面积。

2.定量分析：

校准曲线：为了量化样品中的化合物含量，需要创建校准曲线。该曲线将峰面积或峰高与已知浓度的化合物相关联。将样品的峰面积与校准曲线进行比较，即可确定浓度。

内标：已知浓度的内标通常用于补偿进样量和检测器响应的变化。它们有助于准确定量。

3.定性分析：

光谱数据：有些检测器（如紫外-可见光检测器）可提供光谱信息。吸收光谱的形状有助于确认化合物的身份。共洗脱：当两种或两种以上的化合物在相同的保留时间内洗脱时，可能表明存在共洗脱现象。定性分析可帮助区分和识别这些化合物。

4.数据处理软件：

色谱数据系统（CDS）：用于数据采集和处理的专业软件。这些系统可进行色谱峰积分、校准曲线生成和结果报告。

5.数据验证：

系统适用性测试：在进行样品分析之前，执行系统适用性测试，以确保 HPLC 系统在指定参数范围内运行。这些测试会评估分离度、拖尾因子和塔板数等参数。质量控制标准：在每次分析中加入质量控制 (QC) 标准，以监控系统性能并验证结果的准确性。

6.报告和文件：

结果报告：以标准格式记录和报告分析结果，包括化合物特性、浓度和任何相关信息。方法验证：如果分析属于受监管环境的一部分（如药品），则应遵循既定的方法验证准则， 并相应地报告结果。

7.故障排除：

峰形和拖尾：如果峰形或拖尾不佳，则可能表明色谱柱或流动相存在问题。排除这些问题对保持数据质量至关重要。基线噪声：基线噪声会影响定量的准确性。识别并减少色谱图中的噪声源。

8.数据存储和存档：

数据完整性：遵守数据存储和归档协议，保持数据的完整性，尤其是在数据可追溯性至关重要的监管环境中。

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故障排除

HPLC 是一种强大的分析技术，但与任何实验室方法一样，它也会遇到挑战和问题。有效的故障排除对于及时发现和解决这些问题至关重要。以下是常见的 HPLC 问题和解决策略：

1.基线问题：

• 症状：基线噪声或漂移会使色谱峰模糊不清。
• 可能的原因和解决方案：
• 溶剂污染：确保流动相和溶剂不含杂质或微粒。使用经过过滤的高质量溶剂。
• 气泡：检查并消除流动相管路中的气泡，并对溶剂进行适当脱气。
• 泄漏：检查系统是否泄漏，尤其是连接处和接头。根据需要拧紧连接处。
• 检测器问题：按照制造商的建议清洁或维护检测器。

2.色谱峰拖尾

• 症状：色谱峰出现拖尾或形状不对称。
• 可能的原因和解决方案：
• 色谱柱污染：色谱柱上的污染物可能会导致拖尾。清洁或更换色谱柱。
• pH 值不正确：确保流动相的 pH 值符合色谱柱规格。
• 进样量：使用适当的进样量。色谱柱超载会导致拖尾。
• 样品基质：样品杂质或基质效应会导致拖尾。可考虑进行样品清理或采用不同的样品制备方法。

3.分离度差：

• 症状：色谱峰分离不佳。
• 可能的原因和解决方案：
• 流动相组成：调整流动相组成，包括溶剂比例或梯度程序，以改善分离效果。
• 色谱柱选择：考虑使用不同的色谱柱键合相或尺寸来提高分离度。
• 色谱柱老化：如果色谱柱老化，应予以更换。

4.峰分裂：

• 症状：单个峰分裂成多个较小的峰。
• 可能的原因和解决方案：
• 流动相降解：流动相成分可能会随着时间的推移而降解。准备新的流动相溶液。
• 检测器饱和：如果检测器因分析物浓度过高而饱和，请稀释样品或调整检测器设置。
• 色谱柱过载：减少样品注入量或浓度，防止色谱柱过载。

5.灵敏度降低：

• 症状：检测器信号减弱或无信号。
• 可能的原因和解决方案：
• 检测器问题：检查检测器是否有问题，如更换灯管或清洁检测器单元。
• 流动相流速：确保流动相流速正确。流速过低会降低灵敏度。
• 进样量：使用适当的进样量，防止检测器饱和。

6.保留时间漂移：

• 症状：每次运行的保留时间都不同。
• 可能的原因和解决方案：
• 流动相成分：检查流动相的成分是否一致。
• 色谱柱温度：确保色谱柱温度稳定。
• 色谱柱平衡：每次运行前，让色谱柱在起始条件下平衡适当的时间。

7.结果不可再现：

• 症状：各次运行的结果不一致。
• 可能的原因和解决方案：
• 样品制备：确保样品制备的一致性和可重复性。
• 色谱柱平衡：样品分析前，通过多次进样调节色谱柱以稳定性能。
• 仪器维护：定期维护和校准 HPLC 系统。

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直播预告

直播主题：《HPLC设备原理、操作及应用》

直播时间：11月21日（周四）17:00-18:00

直播大纲：

1. 设备的原理
2. 设备的操作
3. 设备的应用